In vivo assays with natural promoters

Estudio de eficacia de aceites esenciales ante una infección experimental de Salmonella Enteritidis en gallinas ponedoras en producción

B. Huerta¹, F. Ponsa ², G. Ordóñez ², N. Fernández ³, P. Peñalver¹

1 Departamento de Sanidad Animal, Universidad de Córdoba, Córdoba
2 CESAC, Centre de Sanitat Avícola de Catalunya i Aragó, Reus, Tarragona
3 Real Escuela de Avicultura, Arenys de Mar, Barcelona

Resumen

Ensayo experimental (con 384 gallinas ponedoras IsaBrown de 18 semanas de edad), para establecer la eficiencia de un producto comercial basado en el aceite esencial de Eugenia caryophyllata contra Salmonella Enteritidis. Los resultados obtenidos tras 6 semanas de estudio post- infección en análisis de heces fueron de 8,3% de detección de S. Enteritidis en animales infectados y tratados frente a 12,5% de detección en animales infectados y no tratados. Al final de la prueba se sacrificaron 6 animales de cada grupo de estudio, aislándose S. Enteritidis sólo del pool de hígado, corazón y ciego del grupo infectado pero no tratado.

Abstract

An experimental assay has been done (with 384 IsaBrown young hens aged 18 weeks old), to establish the efficiency of a commercial product based on Eugenia caryophyllata essential oil, against Salmonella Enteritidis. The results obtained in the analysis of the faeces after 6 weeks of post infection were 8.3% of detection of S. Enteritidis in the infected and treated group, versus 12.5% of detections in the infected and untreated animals. At the end of the trial, 6 animals from each study group were humanely sacrificed, isolating S. Enteritidis from pool of the liver, heart and cecum only in the inoculated and untreated group.

Palabras clave

Eugenol, Eugenia caryophyllata, Salmonella Enteritidis, gallinas ponedoras

Introducción

En muchos países del mundo, las toxiinfecciones alimentarias son la causa más común de enfermedades entéricas humanas. Dentro de las mismas, las especies del género Salmonella son con frecuencia las responsables de más del 50% de los brotes registrados en un país, con una marcada participación en los mismos de los serovares Enteritidis y Typhimurium. La incidencia de salmonelosis en el hombre, asociada al papel de los animales como reservorio principal, y especialmente importante en colectivos sensibles como los niños, ancianos y personas inmunodeprimidas, ha determinado una decidida atención hacia esta zoonosis en el marco de las competencias y responsabilidades de la Salud Pública y la Medicina Veterinaria (C.J. Thorns, 2000).

Los estudios epidemiológicos han reflejado que son los huevos y la carne de pollo los alimentos de mayor riesgo para el contagio del hombre, centrando las medidas de prevención de la salmonelosis en la obtención de productos avícolas exentos de este microorganismo (Centro Nacional de Epidemiología. Instituto de Salud Carlos III. Madrid). En este sentido, las acciones de restricción desarrolladas por la Unión Europea, que limitan el uso de los antimicrobianos como promotores del crecimiento animal, han centrado la atención de los investigadores en el poder bactericida de productos naturales como los aceites esenciales.

Desde la antigüedad, el aceite esencial de clavo (Eugenia caryophyllata) ha sido utilizado por los pueblos del sudeste asiático para sazonar y conservar los guisos de carne y pescado. A principios del siglo XX, previo al descubrimiento de los antibióticos, W. A. Briggs resalta el poder antiséptico del aceite esencial de clavo diluido para la desinfección de los cirujanos y comadronas, así como de los campos operatorios y heridas. H. Leclerc lo recomienda para la desinfección del cordón umbilical (Valnet, 2001). En la actualidad, es utilizado en cirugía dental como desinfectante y cauterizante (Bruneton, 2001).

Ensayos sobre la actividad antimicrobiana in vitro de varios aceites esenciales de plantas sobre cepas de S. Enteritidis, desarrollados por el Departamento de Sanidad Animal de la Universidad de Córdoba, han puesto de manifiesto el notable poder bactericida del aceite esencial de clavo frente a estas bacterias, con una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 0.25% (v/v) (Huerta et al., 2003).

A partir de estos resultados iniciamos una experiencia de campo sobre la mejora de los índices productivos en gallinas reproductoras alimentadas con un preparado aromático natural a base de aceite esencial de Eugenia caryophyllata, observándose una ausencia total de salmonelas en las heces de las gallinas alimentadas con este compuesto.

En base a estos hallazgos y a la justificada importancia de S. Enteritidis en las toxiinfecciones alimentarias del hombre, se plantea la realización de una infección experimental en 192 gallinas ponedoras a la dosis de 10³ ufc/ml y animal, para probar la eficacia del aceite esencial de Eugenia caryophyllata frente a este microorganismo.

Material y métodos

PREPARADO AROMÁTICO

El preparado aromático tenía como principal componente el aceite esencial de clavo, de origen natural, en un excipiente inerte de dióxido de silicio amorfo. La valoración química de los componentes del aceite se realizó mediante Gas Chromatography / Quadrupole Mass Spectroscopy (Hewlet Packard 5973), comprobándose que su perfil correspondía al descrito en las clasificaciones botánicas para Eugenia caryophyllata y que la concentración de Eugenol en el preparado comercial era del 20%.

POLLITAS

Para la prueba se utilizaron 384 pollitas de la raza IsaBrown. Antes de iniciarla, el día 30-12-2002, (teniendo las pollitas 17 semanas de edad) se realizó un estudio microbiológico para determinar la ausencia de infecciones latentes por Salmonella spp. La inoculación se hizo el día 29-01-2003, teniendo las pollitas 21 semanas de vida. Durante este periodo las pollitas no estuvieron expuestas a contagio.

Los animales se alojaron en una granja de ladrillos de 8,5 x 25 m de la Real Escuela de Avicultura, Arenys de Mar (Barcelona), que cumplía con todas las medidas de ventilación, temperatura, luz (natural y artificial; 10 lux / 15 horas diarias) e higiene necesarias para el control de las enfermedades multifactoriales más frecuentes en esta especie animal.

Se realizaron cuatro grupos de ensayo (A, B, C y D) con 96 pollitas cada uno. Cada grupo, a su vez, estaba compuesto por tres lotes (ensayos simultáneos dentro del mismo grupo) de 32 pollitas cada uno, alojadas en baterías tipo "California" (Big Dutchman) con jaulas de 50 x 46 cm (Directiva Europea 1999/ 74) para 4 animales cada una. Dada la imposibilidad de tener una separación física entre los grupos que serían inoculados y los grupos control, se optó por poner los grupos A y B en las jaulas del principio de la nave y dejar un espacio de más de 10 metros de jaulas vacías respecto a los grupos C y D, que se colocaron al final de la nave.

Se les suministró agua potable y pienso "ad libitum" mediante sistemas de tetinas (2 por jaula) y comederos, estos últimos situados frente a las jaulas.

PIENSO COMERCIAL

Para la alimentación de las pollitas se adquirió un pienso comercial de iniciación de puesta, en harina y ensacado, libre de antimicrobianos eficaces frente Salmonella spp., incluidos los ácidos grasos de cadena corta.

Para confirmar que el pienso no tratado se hallaba libre de Salmonella spp. fue analizado en el CESAC (Centre de Sanitat Avícola de Catalunya i Aragó), Reus (Tarragona).

La adición del aceite esencial al pienso comercial que se había de suministrar a dos de los grupos de ensayo (B y D) se llevó a cabo diariamente en la propia granja mediante una mezcladora.

CULTIVO DEL INÓCULO

El inóculo fue preparado en el CESAC a partir de una cepa de Salmonella serovar Enteritidis aislada de un lote de aves infectadas de forma natural.

La cepa mantenida en cultivo puro, se reactivó mediante crecimiento en Medio líquido Caldo Nutritivo (Oxoid, CM67) incubado a 37ºC durante 24 horas. Para el recuento de microorganismos se realizó una dilución seriada en base 10 en tampón fosfato (Merck, 15525) y siembra en el medio sólido BGA (Brilliant Green Agar; Difco, 22850). Del recuento obtenido se diluyó el medio líquido hasta alcanzar una concentración de 10³ ufc/ml.

La solución del inóculo (10³ ufc/ml) se preparó el mismo día de su aplicación a las aves.

INOCULACIÓN A LAS AVES

Técnicos del CESAC, desplazados el día 29-01-2003 a la granja experimental de la Real Escuela de Avicultura, administraron directamente en el buche de las 192 aves, de forma individual, 1 ml del inóculo preparado.

Se aplicó la dosis infectiva de 10³ salmonelas/ave siguiendo las experiencias realizadas por T. J. Humphrey (1989) como dosis moderada-baja de infección.

DISEÑO DEL ENSAYO

En la tabla 1 se recoge un resumen del diseño del ensayo, con el protocolo seguido para cada uno de los grupos formados. Los animales de los grupos A y C recibieron diariamente y durante toda la experiencia, el pienso comercial sin preparado aromático y los de los grupos B y D el mismo pienso con el aceite esencial incorporado. Ninguna de las pollitas recibió otra medicación que la establecida para su grupo.

Tabla 1. Descripción detallada del diseño del ensayo

Grupos Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D
Preparado aromático NO SI NO SI
Inoculación con S. Enteritidis NO NO Salmonella Enteritidis Salmonella Enteritidis
Nº identificación de los lotes 9/5/1 10/6/2 11/7/3 12/8/4
Nº Pollitas 96 (3x32) 96 (3x32) 96 (3x32) 96 (3x32)

A los 30 días de llegar a la granja y una vez alcanzado el 5 % de puesta media, se procedió a la inoculación oral de las pollitas de los grupos C y D, de forma individual mediante una jeringa directamente en el buche, con 1 ml de la suspensión de Salmonella Enteritidis, de forma que cada animal recibió aproximadamente 10³ ufc (Humprey y col., 1989)

El seguimiento del estado sanitario de las aves y el control de las mezclas de pienso con el preparado aromático fueron realizados diariamente en la Real Escuela de Avicultura.

MUESTREO PARA DETECCIÓN DE SALMONELAS

Todas las muestras obtenidas para la detección de salmonelas se procesaron según normativa ISO 6579, en el CESAC.

Antes de iniciarse la prueba experimental se realizaron controles de pienso (25 g) y animales (25 g de heces frescas).

Durante la prueba experimental, el programa de muestreo fue el siguiente:

1. Muestras fecales (25 g de heces frescas recogidas de forma colectiva del suelo de las jaulas). Las muestras se analizaron colectivamente por lotes (cada 32 animales).

- Día anterior a la inoculación.
- Días posteriores a la inoculación.
- 5 días post-inoculación.
- Semanalmente durante las 7 semanas siguientes.

2. Vísceras: pool de hígado, corazón y ciego de 6 animales de cada grupo (2 de cada lote), escogidos al azar. Se analizaron solamente 2 animales de cada lote ya que la prevalencia de infección era del 100% (inoculación animal por animal).

Final de la prueba experimental (45 días post-inoculación).

Resultados

Los análisis de detección de Salmonella spp. en pienso y animales antes de iniciar la prueba fueron negativos.

En los resultados detallados en la tabla 2 puede observarse que la distribución de aislamiento de S.Enteritidis en heces no siguió un patrón, sino que hubo aislamientos distribuidos de forma dispersa entre las 21 y 26 semanas de vida.

Tabla 2.- Tabla de resultados del aislamiento de S. Enteritidis en heces y vísceras.

S. Ent.: Salmonella Enteritidis

Sólo fue positivo a Salmonella Enteritidis el pool de vísceras de los seis animales del grupo C (inoculados y no tratados).

Discusión

Referente al aislamiento de Salmonella Enteritidis en análisis de heces post-infección experimental, los resultados indican que los grupos de animales tratados tienen una protección relativa frente a los animales no tratados (8.3% de S. Enteritidis en lote tratado e infectado (2/24) frente a 12.5% en animales no tratados e infectados (3/24)).

El dato más relevante de una infección sistémica por S. Enteritidis es el análisis de aislamiento en vísceras de los animales en estudio. Sólo se detectó S. Enteritidis en el pool de hígado, corazón y ciego de los seis animales analizados del grupo C (inoculado sin tratamiento). El resultado fue negativo en el resto de pools de los grupos.

Aunque se detectó S. Enteritidis en heces, el contraste de resultados con las vísceras de los animales puede explicarse por el momento de detección y su distribución. En el grupo B (no inoculados con tratamiento) se aisló S. Enteritidis en las heces de forma puntual en la 1ª semana post-infección de uno de los lotes y sin ningún otro aislamiento posterior en estos animales ni en los otros lotes. Este hecho podría explicarse como una contaminación cruzada de las heces a través de algún vector (roedores, por ejemplo) ya que tampoco se aisló S. Enteritidis en las vísceras.

En el grupo C (inoculado y no tratado) el aislamiento de S. Enteritidis se vio en todos los lotes (dos de ellos al final del estudio) y en el pool de las vísceras, aunque la detección de la salmonela inoculada se esperaba que fuese más temprana.

En el grupo D (inoculado y tratado) se detectó S. Enteritidis en heces en la 1ª y 4ª semanas post-infección sólo en uno de los lotes pero con resultados negativos en los otros lotes y en el pool de vísceras. Es posible que el tratamiento hubiese sido capaz de eliminar las salmonelas en estos lotes ya que no las pudimos detectar ni en heces ni en el pool de vísceras.El tratamiento tiene una protección relativa ya que en dos de los lotes nunca apareció S. Enteritidis.

La falta de repetición de resultados entre lotes, en las heces, dada la eliminación intermitente de la bacteria, no permite sacar conclusiones definitivas en este estudio pero sirve para plantear estudios futuros.

La utilización de Eugenia caryophyllata como aditivo al pienso puede ser un arma más en el control de la infección por Salmonella Enteritidis en avicultura. La importancia de este producto radica en que no es medicamentoso y consecuentemente no contiene residuos perjudiciales para el consumo humano de los productos avícolas.

Agradecimientos

A Núria Llopis (Lidervet, S.L.) por la colaboración en la consecución de la redacción del trabajo. Trabajo promovido por Lidervet S.L., Tarragona. Lidervet S.L. no ha intervenido en el diseño del ensayo ni en las fases del mismo, incluida la interpretación de los resultados.

Proveedores:
Pienso compuesto: Agrovic Alimentación S.A., Tarragona
Producto aromático: a base de Eugenia caryophyllata. Lidervet S.L., Tarragona
Pollitas: Granja Ruano, Amposta, Tarragona
Inóculo de Salmonella Enteritidis: CESAC, Reus, Tarragona

Referencias bibliográficas

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